پروٹین کی طہارت کی درکار کی ضرورت پروٹین کے ارادہ کے آخر میں استعمال پر منحصر ہے.
کچھ ایپلی کیشنز کے لئے، خام تیل کافی ہے. تاہم، کھانے کی اشیاء اور دواسازی کے طور پر دوسرے استعمال کے لۓ، اعلی سطح کی طہارت کی ضرورت ہوتی ہے. یہ پروٹین صاف کرنے کے طریقوں کو حاصل کرنے کے لئے صاف طور پر صاف کرنے کے اقدامات کی ایک سلسلہ میں استعمال کیا جاتا ہے.
ہر ایک پروٹین صاف قدم عام طور پر کچھ ڈگری کی مصنوعات کے نقصان میں پایا جاتا ہے. لہذا، ایک مثالی پروٹین صافی کی حکمت عملی ایک ہے جس میں سب سے کم سطح پر صاف طول و عرض تک پہنچ جاتا ہے. استعمال کرنے کے لئے کون سا مرحلے کا انتخاب سائز، چارج، سوراخ کرنے والی اور ہدف پروٹین کے دیگر خصوصیات پر منحصر ہے. ایک ہیٹیوولک پروٹین صاف کرنے کے لئے مندرجہ ذیل تراکیب سب سے زیادہ مناسب ہیں. cytosolic پروٹین کی پیچیدگیوں کی صاف زیادہ پیچیدہ ہے اور عام طور پر اس کی ضرورت ہے کہ مختلف طریقوں کو لاگو کیا جائے.
پروٹین صاف کرنے کے لئے پہلا مرحلہ
انٹرایکولر ( حج کے اندر اندر) پروٹین صاف کرنے میں پہلا قدم خام تیل کی تیاری ہے.
اسٹیشن میں سیل سیٹوپلاسمس، اور کچھ اضافی میکومولوکولس، کوفیکٹور اور غذائی اجزاء کے تمام پروٹینوں میں پیچیدہ مرکب شامل ہوگا. تاہم، بایو ٹکنالوجی میں بعض ایپلی کیشنز کے لئے خام تیل نکالنے کے لئے استعمال کیا جا سکتا ہے، تاہم، اگر پاکیزگی ایک مسئلہ ہے تو بعد میں صاف کرنے کے بعد اقدامات کئے جائیں گے.
سیل لیزس کی طرف سے پیدا سیلولر ملبے کو ہٹانے سے خام پروٹین کے نکات تیار کیے جاتے ہیں، جو کیمیکلز اور انزیمز ، سونیکشن یا فرانسیسی پریس کا استعمال کرتے ہوئے حاصل کئے جاتے ہیں. ملبے کو سینٹرائیوگریشن کے ذریعہ ہٹا دیا جاتا ہے، اور سرطنیہ کو برآمد کیا جاتا ہے. extracellular پروٹین کی خام تیاریوں کو صرف سینٹرائیوگریشن کی طرف سے خلیات کو ہٹانے کی طرف سے حاصل کی جا سکتی ہے.
کچھ بایو ٹیوٹولوجی ایپلی کیشنز کے لئے، تھومسٹسٹبل اینجیمز کے لئے ایک مطالبہ ہے : انزائیمس جو ڈسپلے کرنے کے بغیر اعلی درجہ حرارت برداشت کر سکتی ہے، اور اعلی خاص سرگرمی کو برقرار رکھنے میں. آبی ادویات جو پیدا کرتے ہیں انہیں کبھی کبھی انتہاپسند کہتے ہیں. گرمی مزاحم پروٹین کو صاف کرنے کے لئے آسان طریقہ یہ ہے کہ دیگر پروٹین کو گرمی کے ذریعے مرکب میں رد کردیں، پھر اس حل کو ٹھنڈا کرنا پڑا (اس وجہ سے اگر ضروری ہو تو ترمیم کرنے والی اینجائم اصلاح یا ریڈیولول کی اجازت دی جاسکتی ہے.
انٹرمیڈیٹ طہارت کے اقدامات
ماضی میں، خام تیل سے ایک پروٹین صاف کرنے کا ایک عام دوسرا مرحلہ اعلی آتھوٹک طاقت (مثلا نمک حل) کے ساتھ حل میں ورنہ ہوا. خام تیل میں نکلک ایسڈ ہٹا دیا جا سکتا ہے جو اسٹرپٹومی سنین سلفیٹ یا پروٹامین سلفیٹ کے ساتھ بنایا گیا ہے.
عام طور پر پروٹین کی سطح نمک کے طور پر امونیم سلفیٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا جاتا ہے.
مختلف پروٹین امونیم سلفیٹ کے مختلف حفظان صحت میں نمٹنے کے لئے تیار ہیں. عام طور پر، امونیم سلفیٹ کے نچلے سنجیدگی میں اعلی آلودگی کے وزن کے پروٹین کو درست. نمک کی ورنج عام طور پر انتہائی صاف پروٹین کی قیادت نہیں کرتا لیکن نمونہ میں کچھ غیر ناپسندیدہ پروٹینوں کو ختم کرنے میں مدد کرسکتا ہے اور نمونہ سنبھال سکتا ہے. حل میں سیلز پھر ڈائلیزیز کے ذریعے خلیج سیلولوز نلیاں، فلٹریشن، یا جیل سے خارج ہونے والی کرومیٹریگرافی کے ذریعے ہٹا دیا جاتا ہے.
جدید بائیوٹیک پروٹوکول اکثر معیاری طریقہ کار کے لئے تیار کردہ حل فراہم کرتے ہیں جو بہت سے کاروباری طور پر دستیاب کٹس کا فائدہ اٹھاتے ہیں. پروٹین صافی اکثر فلٹر اور تیار جیل فلٹریشن کے کالمز کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جاتا ہے. آپ سب کو کرنا ہے ہدایات پر عمل کریں اور صحیح حل کے صحیح حجم کو شامل کریں اور ایک تازہ ٹیسٹنگ ٹیوب میں اختتام جمع کرنے والے (کالم کا دوسرا اختتام کیا) جمع کرتے وقت مقرر کردہ لمبائی کا انتظار کریں.
- Chromatographic طریقوں کو بینچ کے سب سے اوپر کالمز یا خود کار طریقے سے HPLC سامان کا استعمال کرتے ہوئے لاگو کیا جا سکتا ہے. HPLC کی طرف سے علیحدگی کی طرف سے ریورس مرحلے، آئن تبادلہ یا سائز خارج ہونے والے طریقوں، اور ڈایڈور سر یا لیزر ٹیکنالوجی کی طرف سے پتہ چلا نمونے کی طرف سے کیا جا سکتا ہے.
پروٹین کی نمائش کی تشخیص اور تشخیص
- ریورس مرحلے کرومیٹریگ (RPC) ان کے رشتہ دار ہائیڈروفوبائٹس پر مبنی پروٹین کو الگ کرتا ہے. یہ تکنیک انتہائی انتخابی ہے لیکن نامیاتی سالوینٹس کے استعمال کی ضرورت ہوتی ہے. کچھ پروٹین مستقل طور پر سالوینٹس کی طرف سے انکار کر رہے ہیں اور آر پی سی کے دوران فعالیت کو کھو دیں گے. لہذا اس طریقہ کو تمام ایپلی کیشنز کے لئے سفارش نہیں کی جاتی ہے، خاص طور پر اگر ہدف پروٹین کی سرگرمی برقرار رکھنا ضروری ہے.
- آئن ایکسچینج کرومیٹریگرافی چارج کے مطابق پروٹین کی علیحدگی کا حوالہ دیتے ہیں. کالم یایئن ایکسچینج یا کیشن ایکسچینج کے لئے تیار کیا جا سکتا ہے. آئنڈ ایکسچینج کالموں کو ایک اسٹیشنری مرحلے میں مثبت چارج ہے جس سے منفی طور پر چارج شدہ پروٹین کو اپنی طرف متوجہ کیا جاتا ہے. کیشن ایکسچینج کالم ریورس، منفی طور پر الزام لگایا موتیوں کی مالا ہے جو مثبت طور پر چارج پروٹین کو اپنی طرف متوجہ کرتی ہے. ہدف کے پروٹین کی تزئین کی کالم میں پی ایچ ایچ کو تبدیل کر کے کیا جاتا ہے، جس میں ہر پروٹین کے چارج فعل گروپوں کی تبدیلی یا غیر جانبدار ہونے کا نتیجہ ہوتا ہے.
- سائز سے باہر نکلنے والے کرومیٹریگرافی ( جیل فلٹریشن ) بڑے پروٹین کو چھوٹا سا چھوٹا سا چھوٹا سا الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ الگ کرتا ہے. بڑے پروٹین پالیمر کے pores میں فٹ نہیں ہوتے ہیں جبکہ چھوٹے پروٹین کرتے ہیں، اور ان کے کم براہ راست راستے کے ذریعہ، کرومیٹریگ کالم کے ذریعہ سفر کرنے کے لے جاتے ہیں. یلئٹ کو احتیاط کے وقت کی بنیاد پر پروٹین الگ کرنے والی ٹیوبوں کی ایک سیریز میں جمع کیا جاتا ہے. جیل فلٹریشن ایک پروٹین نمونہ کو سنبھالنے کے لئے ایک مفید ذریعہ ہے کیونکہ ابتدائی طور پر کالم میں اضافی ہدف سے کم ہدف مقدار میں ہدف پروٹین جمع کیا جاتا ہے. اسی طرح فلٹریشن کی تکنیکوں کو ان کی لاگت کی تاثیر کی وجہ سے بڑے پیمانے پر پروٹین کی پیداوار کے دوران استعمال کیا جا سکتا ہے.
- ارتباط کرومیٹریگ "پالش" یا پروٹین صاف کرنے کے عمل کو مکمل کرنے کیلئے ایک بہت مفید تکنیک ہے. کرومیٹریگراف کالم میں موتیوں کی مالکان لگینڈس سے متصل ہوتے ہیں جو خاص طور پر ہدف پروٹین کے ساتھ باندھتے ہیں. اس کے بعد پروٹین کو آزاد لیگینڈس پر مشتمل حل کے ساتھ رینجنگ کرکے کالم سے نکال دیا گیا ہے. یہ طریقہ کار دیگر تکنیکوں کے مقابلے میں خالص ترین نتائج اور سب سے زیادہ مخصوص سرگرمی فراہم کرتا ہے.
- SDS -PAGE polyacrylamide جیل الیکٹروفورسس ہے، جس میں SDS (سوڈیم ڈڈیکیل سلفیٹ) کی موجودگی میں انجام دیا گیا ہے جو پروٹین کو ان کے بڑے نیٹ منفی چارج فراہم کرتا ہے. چونکہ تمام پروٹینوں کا الزام منصفانہ برابر ہے، یہ طریقہ ان کو تقریبا مکمل طور پر سائز کی بنیاد پر الگ کرتا ہے. SDS-صفحہ اکثر ایک سلسلے میں ہر قدم کے بعد پروٹین کی طہارت کی جانچ کرنے کے لئے استعمال کیا جاتا ہے. جیسا کہ ناپسندیدہ پروٹین آہستہ آہستہ مرکب سے ہٹا دیا جاتا ہے، ایسڈیڈی پاج جیل پر بصیرت کی بینڈ کی تعداد کم ہو جاتی ہے، جب تک کہ مطلوبہ پروٹین کی نمائندگی نہ ہو.
- امونوبلوٹنگ ایک پروٹین کی نظریاتی تخنیک ہے جو انفرادی کرومیٹریگرافی کے ساتھ استعمال ہوتا ہے. ایک مخصوص پروٹین کے لئے اینٹی بائیوں کو انفرادی کرومیٹریگ کالم پر لیگینڈس کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے. ہدف کے پروٹین کو کالم پر برقرار رکھا جاتا ہے، پھر نمک حل یا دیگر ایجنٹوں کے ساتھ کالم رینج کرکے ہٹا دیا گیا ہے. کسی بھی مرکب سے علیحدگی کے بعد ہدف پروٹین کا پتہ لگانے میں ریڈیویکٹو یا ڈائی لیبلز سے منسلک اینٹی بائیوڈس.
ذرائع:
زبئی جی. 1988. بایو کیمسٹری، دوسرا ایڈیشن. میکلین پبلشنگ کمپنی، نیویارک، نیویارک، امریکہ.
امرسھم فارماسیا بائیوٹیک. 1999. پروٹین صافی ہینڈ بک، ایڈیشن AB. ایمرسھم فارماسیا بائیوٹیک انکارپوریٹڈ نیو جرسی، امریکہ. http://www.biochem.uiowa.edu/donelson/Database٪20items/protein_purification_handbook.pdf.